AVANCES EN EL DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE SALMONELLA

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 PCR aplicada a la avicultura y a la microbiología de los alimentos

 

enlace de origen

Alejandra Velilla

Lab. de Bacteriología-Lab. de Biotecnología INTA EEA Balcarce.

Dr. Horacio Terzolo

Lab. de Bacteriología INTA EEA Balcarce.

Dr. Sergio Feingold

Lab. de Biotecnología Agrícola INTA EEA Balcarce.

Abril 2004

 

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Incidencia, Adquisición y Modos de transmisión de Salmonella
 

El Género Salmonella (S), agente etiológico de la salmonelosis, afecta a aves de corral, vacunos, porcinos y ovinos, entre otras especies. Estas bacterias, son los más frecuentes agentes causales de enfermedades transmitidas por alimentos (ETAs). En el período 1995-1999 fueron el segundo grupo bacteriano más importante causante de ETA en Latinoamérica y el Caribe. La carne de aves, huevos y productos derivados son alimentos que, muy frecuentemente, ocasionan brotes de ETAs.

Estudios epidemiológicos, indican que las aves constituyen un importante reservorio y son fuente de contaminación de los alimentos. La infección de poblaciones de aves de corral fue notificada por primera vez a finales de la década de 1970, y luego durante la década de 1980 se expandió rápidamente a través del Reino Unido, Estados Unidos, América del sur y otras áreas. Durante este período, la proporción de casos de salmonelosis atribuidos a S. serovar (sv) Enteritidis se incrementó sustancialmente, por ejemplo en Argentina esta enfermedad aumentó 275 veces.

El Género Salmonella, no es parte de la flora intestinal normal de las aves, sino que lo adquieren en el ambiente en que viven de insectos, roedores, aves silvestres y el hombre, así como por medio del alimento balanceado y por condiciones predisponentes cuando se crían en forma intensiva. Las salmonelas colonizan el tracto entérico de las aves y posteriormente su materia fecal, la cual contamina la cáscara de los huevos durante su pasaje a través de la cloaca y las salmonelas depositadas en las cáscaras pueden penetrar en la albúmina o clara a través de los poros, donde permanecen latentes. Esta penetración se produce por un proceso de succión debido a la diferencia térmica existente entre el huevo recién puesto y el ambiente. Este proceso ocurre más frecuentemente en gallinas mayores de 1 año, debido a que los poros de la cáscara son de mayor tamaño. Luego, a medida que el huevo envejece, el hierro contenido en la yema difunde a la albúmina y al mismo tiempo esta clara de huevo disminuye su contenido de lisozima, permitiendo así la multiplicación de las salmonelas que estaban latentes dentro del contenido del huevo.

La materia fecal también puede contaminar a las carcasas durante el procesamiento en los peladeros de aves. Si bien la carne de las aves sanas recientemente sacrificadas es estéril, el tipo de procesamiento que se lleva a cabo en los peladeros puede influir y causar su contaminación. Las condiciones del transporte pueden alterar la flora bacteriana que coloniza el intestino y combinados con el estrés y el hacinamiento que sufren las aves se puede producir un aumento de las salmonelas justo antes de su faena. Después de la faena es muy importante mantener la cadena de frío durante todas las etapas de la comercialización.

Finalmente las medidas de higiene y normas sanitarias en la cocina y los consumidores son fundamentales. Debido a esto, la calidad bacteriológica de la carne de ave depende de distintos factores, algunos de ellos relacionados al transporte, sacrificio del animal y a su comercialización, siendo también muy importante considerar ambos extremos de esta compleja cadena, desde el modo de crianza del ave hasta las normas de higiene de los cocineros y consumidores.

La carne de pollo y los huevos son una de las mayores fuentes de toxiinfección alimentaria en el hombre, siendo Salmonella uno de los principales agentes etiológicos. Datos estadísticos aportados por distintos países señalan que entre el 50 al 90% de las carcasas de pollo pueden estar contaminadas con Salmonella. Sin embargo, es importante destacar que mediante la aplicación de medidas preventivas en la crianza de las aves y en el procesamiento y manejo comercial de los productos alimenticios y sus derivados, aunadas a una educación sanitaria de la población para el manejo correcto de los alimentos, para su almacenamiento y elaboración, es posible reducir considerablemente el grado de contaminación con Salmonella. El conocimiento y la comprensión de las principales fuentes de infección de este patógeno son importantes para el diseño de las medidas de prevención y de control de las infecciones. La epidemiología de la transmisión puede variar para cada serotipo y la importancia de las distintas fuentes de infección varía para cada uno de ellos. Sin embargo, independientemente del serotipo de Salmonella implicado las acciones preventivas y de control deben considerar la importancia de las transmisiones vertical y horizontal.

Paratifosis, Tifosis y Pullorosis
 

Perteneciente al Género Salmonella, S. enterica sv. Enteritidis es una de las más importantes paratifosis de las aves por la alta difusión entre los animales y su patogenicidad para el hombre. La sv. Enteritidis se difunde, principalmente, por transmisión horizontal entre las aves enfermas y en menor grado por trasmisión vertical a través del huevo a la progenie. En el primer caso la infección horizontal se propaga, por excreción fecal, aerosoles y contacto, en los criaderos, plantas de incubación, granjas y plantas de matanza. En el segundo caso, la transmisión vertical involucra tanto a reproductores que contaminan sus progenies de pollitos BB e indirectamente a las plantas de incubación como también a líneas de ponedoras que pueden producir algunos huevos infectivos por contaminación de la cáscara en el momento de mayor excreción fecal de salmonelas. Este es el modo más frecuente de contaminación de los huevos. Además, y sólo excepcionalmente (1 de cada 1.000 huevos analizados), puede contaminarse en forma directa la yema de los huevos en gallinas que sufren septicemia y peritonitis. El manejo de los huevos puede aumentar considerablemente la contaminación cruzada por la re-utilización de maples contaminados y el empleo de huevos mal conservados o viejos.

Las aves adultas son siempre portadoras asintomáticas y pueden transmitir trans-ovo la infección a sus progenies, siendo los pollitos BB los potenciales manifestantes de síntomas, lesiones y mortandad en grado variable, según el nivel de inmunidad maternal heredada de sus padres a través del vitelo. La dispersión sistémica genera transmisión vertical y la excreción fecal extensiva produce contaminación ambiental difícil de eliminar. Con referencia a la importancia e implicancias de Salmonella spp. y especialmente de Salmonella Enteritidis, grupos de trabajo pertenecientes a la Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación (FAO) y la Organización Mundial de la Salud (OMS) examinaron con detenimiento documentos técnicos sobre la identificación, caracterización y evaluación de los peligros de la exposición de Salmonella spp. en pollos de engorda (parrilleros) y huevos.

http://www.fao.org/DOCREP/005/Y4392E/Y4392E00.htm  http://www.fao.org/DOCREP/005/Y4393E/Y4393E00.htm 

 

Asociados a los riesgos para la salud, estos patógenos tienen un significativo impacto económico sobre la industria del huevo. La S. sv. Enteritidis suele causar una infección asintomática en aves adultas y los síntomas de la enfermedad sólo se manifiestan en aves muy jóvenes. En cambio, S. sv. Gallinarum, con sus biovariedades gallinarum y pullorum, causan la Tifosis y Pullorosis respectivamente, las cuales son enfermedades mucho más graves para las aves, tanto adultas como jóvenes, pero no constituyen peligro para el ser humano, ya que el hombre no es susceptible a dichos serovares. Ambas enfermedades han sido erradicadas de los criaderos industriales de la mayoría de los países desarrollados aunque aún persisten en países en desarrollo, incluyendo varios de América Latina. Por este motivo, estas enfermedades si bien no constituyen una zoonosis, deben ser tenidas en cuenta para su diagnóstico diferencial en la región. Además, la Paratifosis y la Tifosis pueden presentarse en forma conjunta en los criaderos de aves, afectando a los mismos individuos en forma simultánea.

 

Fagotipos y patogenicidad de Salmonella Enteritidis en Argentina
 

En las últimas décadas S. entérica sv Enteritidis encabeza la lista de patógenos emergentes y re-emergentes, causantes de ETA en Latinoamérica. En Argentina durante el período 1986-1993 se aislaron 68 cepas de S. sv. Enteritidis de criaderos de pollos parrilleros, reproductores pesados y gallinas ponedoras, y se determinó que el 38 % de las muestras correspondía al fagotipo (PT) 34, el 38% al PT4, el 8% al PT 7 y el 16% restante a los PT 1, PT 5-a, PT 9-a y PT 12. Todas estas cepas presentaron transmisión vertical y horizontal y alta patogenicidad. De este modo, en Argentina la mayoría de las infecciones en criaderos de aves fueron causadas por cepas del PT 4 o sus derivados PT 34 y PT 7. Todas estas cepas tienen muy alta patogenicidad y la mayoría son originarias de Europa, donde se detectaron y describieron los primeros brotes de la enfermedad asociadas al PT 4. Además de esta serovariedad, en segundo lugar deben considerarse cepas patógenas de S. sv. Typhimurium, que si bien actualmente son menos frecuentes como causa de Paratifosis en aves, tienen también mucha importancia por su potencial patogenicidad para el hombre, las aves y los animales.

Salmonella en alimentos
 

En América Latina y el Caribe, la incidencia de las infecciones de origen alimentario produce una tasa de mortalidad por diarrea en menores de 5 años de 0.13 ‰ en Trinidad y Tobago, 0.18 ‰ en Cuba y 9.83 ‰ en Nicaragua. Debido a la falta de reportes, no se poseen datos estadísticos de muchos países de Latinoamérica.

En el período 1995-1999, Salmonella fue el segundo agente causal más importante (35,3%) de brotes de ETA en América Latina y el Caribe. Durante el período 1993-2002 se han registrado en Latinoamérica 1256 brotes de salmonelosis, que afectaron a 48334 personas y produjeron 15 muertes. El 29,2 % de los casos fue consecuencia del consumo de huevos o productos derivados y el 9,4 %, fue debido a la ingesta de carne de aves. El 9,8 % de los brotes fue causado por Salmonella sv Enteritidis y en el 85 % de los casos no se pudo determinar la serovariedad implicada (Fuente: Sistema de Información Regional para la Vigilancia Epidemiológica de las Enfermedades Transmitidas por Alimentos {SIRVETA}). Durante el período 1993-2002 ocurrieron en Argentina 60 brotes de salmonelosis que produjeron 889 enfermos y 4 muertos. El 6,7 % de los brotes fue causado por S. sv Enteritidis, 1,7 % por S. Typhimurium, el 1,7% por S. arizonae y en el 90% de los casos no se pudo identificar la serovariedad correspondiente. Con relación a los alimentos involucrados en dichos brotes el 25% correspondió a derivados de huevo, mayonesa y carne de aves.

 http://www.panalimentos.org/sirveta/e/index.htm 

 Un alto porcentaje de los casos notificados no puede ser asociado con algún alimento en particular o el patógeno responsable no puede ser identificado. Esto ocurre debido a que con frecuencia los resultados de los análisis bacteriológicos demoran y el alimento implicado ya no se encuentra disponible para su análisis. Por ello, la real frecuencia de los aislamientos no siempre se conoce y las publicaciones disponibles reportan muchos menos casos que los existentes. Estos datos apuntalan la necesidad de lograr la rápida detección de Salmonella y otros contaminantes en alimentos. Debido a esto, uno de los principales objetivos en microbiología alimentaria es la identificación del agente causal por procedimientos cada vez más rápidos y seguros. Este hecho exige realizar un control de la calidad bacteriológica de los alimentos que incluye la investigación de especies, familias o grupos bacterianos cuya presencia refleja sus condiciones higiénico-sanitarias. Asimismo, la detección del microorganismo contaminante, directamente en el alimento, prevendría la ocurrencia de enfermedad y las consecuencias que ésta acarrea.

Actuales Técnicas de Diagnóstico
 

La detección e identificación de los patógenos implicados en las enfermedades transmisibles es un componente fundamental de la vigilancia epidemiológica. Debido a esto es necesario estandarizar técnicas de detección para implementar la vigilancia y el control de dichos microorganismos y prevenir las enfermedades que estos producen en el ámbito nacional, regional y /o mundial. Los métodos clásicos de diagnóstico bacteriológico son laboriosos, requieren tiempo y no todas las cepas aisladas pueden ser identificadas, por lo cual la información que brindan es limitada y dificulta la toma de decisiones. La temprana detección de los microorganismos, prevendría la aparición de muchos brotes y permitiría implementar controles previos a la ocurrencia de enfermedad.

Hasta el momento, el aislamiento y la identificación de Salmonella se realiza mediante métodos de cultivo tradicionales, que consisten en las siguientes etapas:

Pre-enriquecimiento en medio líquido no selectivo;

Enriquecimiento en medios líquidos selectivos;

Aislamiento diferencial sobre medios sólidos selectivos;

Confirmación bioquímica de las colonias sospechosas; y

Confirmación serológica de dichas colonias.

 

Todos los medios se incuban en aerobiosis a 37ºC y deben examinarse a las 24 horas. La utilización de sustratos bioquímicos es la base para la identificación del Género Salmonella. Según el método bacteriológico de cada laboratorio las colonias pueden ser inicialmente seleccionadas por algunas pruebas bioquímicas antes de proceder a su biotipificación completa. La confirmación de estas colonias requiere tiempo y la mayoría de ellas no son Salmonella, sino otros géneros relacionados, tales como Proteus o Citrobacter.

http://www.who.int/emc/diseases/zoo/SALM-SURV/pdfs/Level%201_Protocol.pdf

Asimismo, el Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria (SENASA) reconoce la importancia y la necesidad de la existencia de métodos de diagnóstico precisos que caractericen los aislamientos de Salmonella hasta el nivel de serovariedad.

http://www.senasa.gov.ar/sanidad/aves/salmoavi.php 

Las aves infectadas con S. gallinarum y S. pullorum pueden ser detectadas en las granjas con un método serológico rápido utilizando sangre total y un antígeno coloreado en una prueba rápida de aglutinación en placa, aunque las infecciones identificadas mediante este método deben ser confirmadas mediante una técnica bacteriológica clásica. También existen métodos de aglutinación, tales como las técnicas de ELISA, principalmente usada para detectar a S. Enteritidis. La ventaja de los exámenes serológicos es que se detecta la persistencia de los anticuerpos IgG circulantes, aunque el principal inconveniente es que las concentraciones séricas de IgG pueden ser bajas al principio de la infección y por ende indetectables, mientras que la excreción fecal es elevada. Otra ventaja de la prueba de ELISA consiste en su facilidad de aplicación para la detección en gran escala de aves infectadas. Este enfoque ha sido reconocido por la Unión Europea y la Organización Mundial de la Salud (OMS) para S. Typhimurium y S. Enteritidis. También es factible, que dicha técnica reemplace a la prueba rápida de aglutinación en placa para S. gallinarum y S. pullorum.

Nuevo Método de Detección Molecular desarrollado por el INTA de Balcarce
 

Debido al incremento de la prevalencia de S. sv Enteritidis y su complejo ciclo de vida, la existencia de métodos de detección rápidos y efectivos son importantes como base de las estrategias de control. La técnica molecular basada en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, del inglés Polymerase Chain Reaction) ha revolucionado el diagnóstico molecular de las enfermedades infecciosas. A diferencia de los métodos tradicionales, que requieren 6 o 7 días para dar un resultado definitivo, por el método de PCR esto mismo se logra en sólo 1 a 3 días, dependiendo de diversas modificaciones en el protocolo de trabajo.

La técnica de PCR, es un método rápido que posee ventajas inherentes que la caracterizan y por ende es un excelente método aplicable a la detección e identificación de Salmonella y de otros patógenos. Además, las cepas carentes de antígenos somáticos (O) y/o flagelares (H) (cepas rugosas), que sólo son reconocidas como Salmonella spp. por el método tradicional de serotipificación pueden ser identificadas mediante PCR, debido a que esta técnica detecta secuencias específicas de DNA y no es alterada por variaciones fenotípicas, que se pueden evidenciar por patrones bioquímicos.

Nueva Propuesta para el diagnóstico rápido de la Tifosis, Pullorosis y Paratifosis de las aves
 

Considerando la importancia del tema y la necesidad de lograr una detección rápida de las aves infectadas, el Laboratorio de Bacteriología del Área de producción Animal y el Laboratorio de Biotecnología Agrícola, edificio PROPAPA, trabajaron en forma mancomunada. Ambos laboratorios pertenecen a la Estación Experimental del INTA de Balcarce y los objetivos planteados en dicho proyecto conjunto fueron los siguientes:

Estandarizar la técnica de PCR para su aplicación en la detección del Género Salmonella, de cepas virulentas (portadoras del plásmido spv, que les confiere la virulencia) y en la subtipificación molecular del sv. Enteritidis; y

Implementar un servicio de diagnóstico expeditivo y práctico para el envío de muestras a distancia sin la utilización de soportes de vidrio o medios líquidos.
 

Para cumplimentar estos objetivos se utilizaron 70 cepas representativas de 25 serovares de Salmonella y de otros 20 Géneros bacterianos y “primers” específicos del Género Salmonella, del serovar Enteritidis y del citado plásmido de virulencia distintivo de algunos serovares de Salmonella patógenos, entre los que se encuentran, Gallinarum, Enteritidis, Dublin, Typhimurium y Choleraesuis. De este modo, se podría predecir la aparición de brotes, puesto que varios estudios evidencian que este plásmido es responsable de la virulencia de las salmonelas en las enfermedades humanas y se ha comprobado que el mismo es esencial para que la bacteria produzca enfermedad sistémica en animales oralmente inoculados.

En la técnica de PCR que aquí se menciona, se incluye el mencionado “primer” específico de virulencia que identifica cepas de Salmonella potencialmente patógenas por ser portadoras del plásmido spv, un segundo “primer” que detecta específicamente a S. Enteritidis y un tercer “primer” que detecta específicamente y en general a cepas de Salmonella spp.

Además está implementado el sistema de diagnóstico por PCR para Salmonella mediante la utilización de papeles absorbentes especiales para el envío de muestras a distancia por correo postal. Una característica innovadora y práctica del servicio que brindamos, consiste en que las muestras (hisopados de materia fecal, macerados de órganos, etc.) son embebidas en papeles absorbentes que actúan como matrices de soporte. De este modo se evita la utilización de medios de cultivo en tubos o frascos, reemplazando dichos materiales por el simple despacho de un sobre conteniendo los papeles con las muestras a analizar. Todo el material necesario para la recolección de las muestras es provisto por nuestro laboratorio y el envío de los sobres se realiza por correo postal a la EEA de Balcarce.

Aplicaciones en la avicultura, la comercialización de sus productos y en la microbiología de los alimentos
 

Una aplicación importante de esta técnica es la rápida verificación y contralor de la salmonelosis en huevos y pollitos BB que se comercializan entre distintos países, dado que son materiales que requieren un diagnóstico rápido y preciso en las aduanas. Debido a la expansión del comercio internacional es necesario fortalecer las medidas de control sanitario para de este modo evitar la diseminación de numerosos agentes infecciosos entre distintas regiones. Dentro del área de la microbiología de los alimentos, la técnica de PCR puede hacerse extensible a cualquier matriz de alimentos que se desee analizar, tales como muestras de leche y carne vacuna entre otras.

La importancia y la utilidad de las técnicas moleculares está evidenciada por el interés de crear en Latinoamérica una Red de sub-tipificación molecular para la vigilancia de los patógenos transmitidos por alimentos.

http://www.panalimentos.org/panalimentos/art1.asp?id=2960931659&cat=6 

Asimismo, en Europa ha sido creada Enter-net, red internacional para la vigilancia de Infecciones gastrointestinales en el hombre. Esta red monitoriza fundamentalmente Salmonella y Escherichia coli O157 y uno de sus principales objetivos es establecer una base de datos internacional de casos de Salmonella con actualización periódica.

http://www.eurosurveillance.org/em/v04n05/0405-322.asp 

Otra importante Red Europea es Salm-Net, cuyo objetivo es prevenir las salmonelosis humanas en la Unión Europea mediante el refuerzo de la vigilancia internacional con la creación de laboratorios y de una base de datos disponible a todos los participantes. Salm-Net está financiada por el programa BIOMED 1 de la DG XII de la Comisión Europea y es precursora de Enter-Net. La red está compuesta por microbiólogos y epidemiólogos responsables de la vigilancia nacional de la salmonelosis en 14 países europeos. Además Salm-Net tiende a armonizar los métodos de tipificación de fagos de Salmonella Enteriditis, S. Typhimurium y S. Virchow

http://www.eurosurveillance.org/em/v00n00/0000-325.asp 

Una interesante e importante pregunta a responder es ¿Qué acciones son necesarias y deberían ser implementadas para combatir los desafíos constantes que presentan las salmonelas?, varios expertos del tema han reconocido al respecto que es preciso garantizar una especialización epidemiológica suficiente que permita aprovechar los avances en microbiología molecular y estar siempre al día en este campo que evoluciona a una gran velocidad.

http://www.eurosurveillance.org/em/v08n02/0802-321.asp.

De este modo dichos especialistas enfatizan la utilidad y la necesidad de la aplicación de técnicas moleculares tales como la técnica de PCR.

Sólo de esta forma podrá asegurarse el control que requiere la industria alimenticia para conocer la calidad bacteriológica de la materia prima que utiliza en la elaboración de sus productos, así como en las etapas intermedias hasta la obtención del producto terminado. Sólo así, se podrá proporcionar a los consumidores seguridad higiénico-sanitaria.

Esta metodología permite la detección e identificación rápida y precisa de Salmonella, y se encuentra a disposición de todos aquellos que estén interesados en utilizar este nuevo servicio de diagnóstico rápido que ha desarrollado el INTA.

 

Para obtener más información contactarse con:

Alejandra Velilla -  

Dr. Horacio Terzolo -  

Dr. Sergio Feingold -  

 

INTA EEA Balcarce

Laboratorio de Bacteriología - Grupo de Sanidad Animal

Laboratorio de Biotecnología Agrícola - Grupo PROPAPA

RN 226, Km 73,3- (CC276).

B7620 EMA-Balcarce-Bs. As.

Tel: (0226) 43-9121/401

Fax: (0226) 43-9101

 

© Copyright 2002. INTA EEA Balcarce. Ruta 226 km 73,5 (7620) Balcarce, Buenos Aires, Argentina. Tel: 02266-439100, Fax: 439101, Email:

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